Сохранение, мобилизация и изучение генетических ресурсов растений

pdf-версия статьи

УДК УДК: 635.9:582.916.16+577.21

Адаптация молекулярных методов для идентификации сортов Syringa vulgaris L.

Введение

Syringa vulgaris L. (Cирень обыкновенная) - кустарник, естественно произрастающий в Балканских горах, одно из самых декоративных пейзажных растений прохладных и умеренных областей. Мировая коллекция сирени к настоящему времени насчитывает около 2300 сортов, большинство из которых являются сортами сирени обыкновенной (Vrugtman, 2006). Традиционно сорта сирени представлены в большинстве ботанических садов. Часто в коллекциях ботанических садов, университетов, а особенно в исторических сада и парках существуют трудности с идентификацией сортов (Lyakh, 2014).

Правильное определение видовой и сортовой принадлежности растений является одной из важных проблем. Сирень, прежде всего, характеризуется морфологически. Оценка таких особенностей как оттенок соцветия и аромат, часто субъективны и не сохраняются в гербарии. Такая внешняя оценка недостаточно надежна. Анализ ДНК является важным методом для различения видов растений и идентификации культурных сортов. Для решения проблемы генетической идентификации необходимо использование ДНК маркеров (Матвеева и др., 2011). Одним из самых распространенных и информативных методов является анализ электрофоретических спектров межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR). Цель работы – определение наиболее информативных ISSR-праймеров для идентификации сортов сирени обыкновенной.

Объекты и методы исследований

Работа проводилась с 2014 по 2016 годы. Объектами исследования были 9 сортов сирени обыкновенной (рис. 1, 2) из коллекции Центрального сибирского ботанического сада Сибирского отделения Российской Академии наук (ЦСБС СО РАН) в Новосибирске:

1. ‘Память о С. М. Кирове’ (‘Pamyat o S. M.  Kirove’)
2. ‘Огни Донбасса’ (‘Ogni Donbassa’)
3. ‘Индия’ (‘India’)
4. ‘Кружевница’ (‘Kruzevniza’)
5. ‘Надежда’ (‘Nadezdha’)
6. 'Алтайская розовая’ (‘Altaiyskaya rozovaja’)
7. ‘Дафна’ (‘Dafna’)
8. ‘Олимпиада Колесникова’ (‘Olimpiada Kolesnikova’)
9. ‘Красавица Москвы’ (‘Krasavitsa Moskvy’)

В настоящее время коллекция насчитывает 26 сортов, отобранных из 116 сортов зарубежной и отечественной селекции как наиболее устойчивые к условиям Западной Сибири.

Для генетической идентификации сортов сирени обыкновенной использовался метод ISSR-маркирования (Gupta et al., 1994). ДНК выделяли из 10-12 мг растительной ткани высушенных листьев различных годов сбора с помощью СТАВ-метода (Doyle, Doyle, 1990) с некоторыми модификациями. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе С1000 Thermal Cycler (BioRad Laboratories, USA). Для амплификации использовали 15 ISSR-праймеров. Продукты амплификации разделяли при помощи электрофореза в 1 % агарозном геле в 1×ТВЕ буфере, c красителем CYBR-Green. Гели фотографировали в УФ-излучении (Bio-Rad GelDoc XR+).

Рис. 1 Сорт ‘Память о С. М. Кирове’ в коллекции ЦСБС.

Рис. 2. Сорт ‘Надежда’.

Результаты и обсуждение

При экстракции ДНК из растительных объектов часто необходимо удалить вторичные метаболиты, которые мешают изолированию ДНК, а также отрицательно влияют на полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для экстракции высококачественной ДНК S. vulgaris был модифицирован CTAB-метод (Doyle, Doyle, 1990) для 9-ти сортов из коллекции ЦСБС.

Адаптированная нами методика позволяет получать высокую концентрацию ДНК из свежих образцов (52-410 мкг/мл). Однако концентрация ДНК, выделенной этим методом из старого гербарного материала, была не достаточна для дальнейшего анализа. Для получения нужной концентрации путем серии экспериментов была усовершенствована техника выделения геномной ДНК из образцов листьев длительного (от 4 до 10 лет) хранения. Протокол был изменен следующим образом: увеличена концентрация 2-меркаптоэтанола в лизирующем СТАБ буфере до 2 %; осаждение ДНК изопропанолом при -20º C в течение 2 часов; центрифугирование осадка ДНК после добавления изопропанола на скорости 12 g при температуре +4º C 30 минут; очистка осадка в 0,5 мл 70 % этанола (Лях, 2015).

Амплификации ДНК всех 9 сортов проводились с каждым из пятнадцати ISSR-праймеров в двукратной повторности. Были получены и проанализированы 60 электрофореграмм продуктов амплификации ДНК, всего в процессе исследований было проанализировано 540 данных ПЦР.

Несмотря на большой подбор основных параметров ПЦР, таких как концентрация MgCl₂ ; температура отжига и др., при ПЦР с 4-мя праймерами мы не обнаружили продуктов амплификации ДНК на электрофореграммах. Следующие 6 праймеров имели высокий уровень консервативности и не выявили различий между сортами. И только 5 праймеров показали четкие отличия сортов (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК (метод ISSR-PCR) 9 сортов Syringa vulgaris.

Примечание – (праймер (AC)₄CG): М–маркер молекулярных масс, с 1 по 9 – номера сортов.

Выводы и заключение

По данным ПЦР анализа определены 5 наиболее информативных ISSR-праймеров: [(CA)₆AC, (CA)₆RG, (CA)₆AG, (AC)₄CG, (CTC)₃GC] для дальнейшей успешной идентификации сортов сирени обыкновенной. Адаптированные нами методы выделения ДНК, постановки ПЦР и отобранные информативные ISSR-маркеры позволяют проводить идентификацию таксонов S. vulgaris.

В статье использовались материалы “Биоресурсной коллекции ЦСБС СО РАН”, УНУ “Коллекции живых растений в открытом и закрытом грунте”, USU_440534.

Литература