Lyakh E. “Adaptation of molecular methods for Syringa vulgaris L. cultivars identification”, Hortus bot. 12, (2017): DOI: 10.15393/j4.art.2017.4942


Conservation, Mobilization and Study of Plant Genetic Resources

pdf-version 

Adaptation of molecular methods for Syringa vulgaris L. cultivars identification

Lyakh
Elena Mikhailovna
Central Siberian Botanical Garden of SB RAS,
Zolotodolinskaja, st. 101, Novosibirsk, 630090, Russia
llyakh@rambler.ru
Key words:
horticulture, identification, herbarium, analysis of DNA, ISSR primer, common lilac, Syringa vulgaris, Oleaceae, cultivar
Summary: Correct definition of a cultivar and species is a major issue both in science and gardening. Collections of botanical gardens, universities and escpecially historical gardens and parks often have troubles with identifying lilac cultivars. Analyzing electrophoretic patterns of DNA markers is required to identify Syringa vulgaris cultivars. Nine common lilac cultivars from the Central Siberian Botanical Garden's collection in Novosibirsk were studied. A method of pure genomic DNA extraction from dry leaves of S. vulgaris has been adapted. DNA amplifications for each of the 9 cultivars using fifteen ISSR-primers were carried out. As a result of PCR analysis, we have defined five best primers for genotyping common lilac cultivars.
Is received: 03 december 2017 year
Is passed for the press: 21 december 2017 year


Syringa vulgaris L. (Cирень обыкновенная) - кустарник, естественно произрастающий в Балканских горах, одно из самых декоративных пейзажных растений прохладных и умеренных областей. Мировая коллекция сирени к настоящему времени насчитывает около 2300 сортов, большинство из которых являются сортами сирени обыкновенной (Vrugtman, 2006). Традиционно сорта сирени представлены в большинстве ботанических садов. Часто в коллекциях ботанических садов, университетов, а особенно в исторических сада и парках существуют трудности с идентификацией сортов (Lyakh, 2014).

Правильное определение видовой и сортовой принадлежности растений является одной из важных проблем. Сирень, прежде всего, характеризуется морфологически. Оценка таких особенностей как оттенок соцветия и аромат, часто субъективны и не сохраняются в гербарии. Такая внешняя оценка недостаточно надежна. Анализ ДНК является важным методом для различения видов растений и идентификации культурных сортов. Для решения проблемы генетической идентификации необходимо использование ДНК маркеров (Матвеева и др., 2011). Одним из самых распространенных и информативных методов является анализ электрофоретических спектров межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR). Цель работы – определение наиболее информативных ISSR-праймеров для идентификации сортов сирени обыкновенной.

Работа проводилась с 2014 по 2016 годы. Объектами исследования были 9 сортов сирени обыкновенной (рис. 1, 2) из коллекции Центрального сибирского ботанического сада Сибирского отделения Российской Академии наук (ЦСБС СО РАН) в Новосибирске:

  1. ‘Память о С. М. Кирове’ (‘Pamyat o S. M.  Kirove’)
  2. ‘Огни Донбасса’ (‘Ogni Donbassa’)
  3. ‘Индия’ (‘India’)
  4. ‘Кружевница’ (‘Kruzevniza’)
  5. ‘Надежда’ (‘Nadezdha’)
  6. 'Алтайская розовая’ (‘Altaiyskaya rozovaja’)
  7. ‘Дафна’ (‘Dafna’)
  8. ‘Олимпиада Колесникова’ (‘Olimpiada Kolesnikova’)
  9. ‘Красавица Москвы’ (‘Krasavitsa Moskvy’)

В настоящее время коллекция насчитывает 26 сортов, отобранных из 116 сортов зарубежной и отечественной селекции как наиболее устойчивые к условиям Западной Сибири.

Для генетической идентификации сортов сирени обыкновенной использовался метод ISSR-маркирования (Gupta et al., 1994). ДНК выделяли из 10-12 мг растительной ткани высушенных листьев различных годов сбора с помощью СТАВ-метода (Doyle, Doyle, 1990) с некоторыми модификациями. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе С1000 Thermal Cycler (BioRad Laboratories, USA). Для амплификации использовали 15 ISSR-праймеров. Продукты амплификации разделяли при помощи электрофореза в 1 % агарозном геле в 1×ТВЕ буфере, c красителем CYBR-Green. Гели фотографировали в УФ-излучении (Bio-Rad GelDoc XR+).

Fig. 1 Cultivar ‘Pamyat o S. M.  Kirove’ from the Central Siberian Botanical Garden collection.

Fig. 2. Cultivar ‘Nadezdha’.

При экстракции ДНК из растительных объектов часто необходимо удалить вторичные метаболиты, которые мешают изолированию ДНК, а также отрицательно влияют на полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для экстракции высококачественной ДНК S. vulgaris был модифицирован CTAB-метод (Doyle, Doyle, 1990) для 9-ти сортов из коллекции ЦСБС.

Адаптированная нами методика позволяет получать высокую концентрацию ДНК из свежих образцов (52-410 мкг/мл). Однако концентрация ДНК, выделенной этим методом из старого гербарного материала, была не достаточна для дальнейшего анализа. Для получения нужной концентрации путем серии экспериментов была усовершенствована техника выделения геномной ДНК из образцов листьев длительного (от 4 до 10 лет) хранения. Протокол был изменен следующим образом: увеличена концентрация 2-меркаптоэтанола в лизирующем СТАБ буфере до 2 %; осаждение ДНК изопропанолом при -20º C в течение 2 часов; центрифугирование осадка ДНК после добавления изопропанола на скорости 12 g при температуре +4º C 30 минут; очистка осадка в 0,5 мл 70 % этанола (Лях, 2015).

Амплификации ДНК всех 9 сортов проводились с каждым из пятнадцати ISSR-праймеров в двукратной повторности. Были получены и проанализированы 60 электрофореграмм продуктов амплификации ДНК, всего в процессе исследований было проанализировано 540 данных ПЦР.

Несмотря на большой подбор основных параметров ПЦР, таких как концентрация MgCl; температура отжига и др., при ПЦР с 4-мя праймерами мы не обнаружили продуктов амплификации ДНК на электрофореграммах. Следующие 6 праймеров имели высокий уровень консервативности и не выявили различий между сортами. И только 5 праймеров показали четкие отличия сортов (рис. 3).

 

Примечание – (праймер (AC)4CG): М–маркер молекулярных масс, с 1 по 9 – номера сортов.

Fig. 3. Electrophoregram of DNA amplification products (ISSR-PCR method) of 9 Syringa vulgaris cultivars.

Note – (primer (AC)4CG): M-marker of molecular masses, from 1 to 9 – number of cultivars.

По данным ПЦР анализа определены 5 наиболее информативных ISSR-праймеров: [(CA)6AC, (CA)6RG, (CA)6AG, (AC)4CG, (CTC)3GC] для дальнейшей успешной идентификации сортов сирени обыкновенной. Адаптированные нами методы выделения ДНК, постановки ПЦР и отобранные информативные ISSR-маркеры позволяют проводить идентификацию таксонов S. vulgaris.

В статье использовались материалы “Биоресурсной коллекции ЦСБС СО РАН”, УНУ “Коллекции живых растений в открытом и закрытом грунте”, USU_440534.

References

Lyakh E. M. Izmenenie metodiki ekstraktsii genomnoj DNK dlya sortov Syringa vulgaris L. // Problemy botaniki Yuzhnoj Sibiri i Mongolii: A modification of genomic DNA extraction method for varieties of Syringa vulgaris L. // Problems of Botany of Southern Siberia and Mongolia: cb. nautchn. stat. po mater. XIV mezhdunar. nautch.-prakt. konf. (25–29 maya 2015 g., Barnaul). Barnaul: Izd-vo Alt. GU, 2015. S. 351—352.

Matveeva T. V., Pavlova O. A., Bogomaz D. I., Demkovitch A. E., Lutova L. A. Molekulyarnye markery dlya vidoidentifikatsii i filogenetiki rastenij // Genetika populyatsij. Molecular markers for species identification and phylogeny of plants // Genetics of populations. 2011. T. IX. № 1. C. 32—43.

Doyle J. J., Doyle J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. 1990. № 12. P. 13—15.

Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J. L. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simplesequence repeats // Theoret. Appl. Genet. 1994. Vol. 89. P. 998—1006.

Lyakh Elena M. DNA Fingerprinting: Common Lilac cultivars from Historical Park and Botanical Garden Collections // Public Garden. 2014. Vol. 28. № 4. P. 24—26.

Vrugtman Freek. International register and checklist of cultivar names in the genus Syringa L. (Oleaceae) – Hamilton, Ontario, Canada, Royal Botanical Gardens, 2006. 280 p.




Displays: 2949; Downloads: 508;